蚌埠医学院学报

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基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

曹玉洁, 张玲红, 苗昱辰, 卢里, 李春草, 张璐, 胡瑞, 李江艳, 夏惠, 陶志勇, 方强

2023, 48(1): 60-65. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2023.01.012

关键词: 约氏疟原虫, PALM基因, 基因敲除, CRISPR/Cas9

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目的基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息, 设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂, 将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接, 构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体, 尾静脉注射感染小鼠, 24 h后采血查获疟原虫后, 给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫, 喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定, 最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠, 8 d后采血镜检疟原虫, PCR鉴定, 筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内, 每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)。对感染后的小鼠每2天鼠尾取血制作血涂片, 经吉姆萨染色后镜检计算原虫率, 记录数据进行统计学分析。结果PCR扩增出的PALM左右同源臂各600 bp以及sgRNA序列, 与载体pYCm-golden-blue连接后成功获得用于电转染的PALM基因敲除的CRISPR质粒。该质粒电转染的疟原虫在小鼠体内经药物压力筛选8 d, 用PALM基因内部引物经PCR检测显示PALM基因缺失, 用基因组特异性引物经PCR检测出现阳性重组条带, 片段长度1 246 bp。随后将阳性重组条带切胶测序, 测序结果进一步证实PALM基因敲除成功。在获得约氏疟原虫PALM基因敲除株的基础上, 通过有限稀释感染12只小鼠, 经PCR自2只小鼠血液中扩增出单一PALM基因敲除条带, 检测不到野生型疟原虫的残留, 获得了2个100%PALM基因敲除的单克隆虫株。PALM基因敲除单克隆株与P.yoelii 17XNL感染小鼠后均出现原虫血症, 且2组小鼠原虫率逐日升高。感染后第10天, 2组小鼠原虫血症水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建并单克隆化PALM基因敲除的P.yoelii 17XNL虫株, 为疟疾遗传减毒红前期活疫苗研发提供准备。

三阴性乳腺癌90例临床特征及生存情况分析

张露, 郑荣生, 汪子书, 王俊斌, 杨燕

2015, 40(4): 434-439. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.04.005

关键词: 乳腺肿瘤, 三阴性临床特征, 生存分析, 预后

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ST段抬高型心肌梗死病人远期死亡率与入院首次化验时平均血小板体积的关系

杨楠, 陈宇, 易诗琼, 张露

2021, 46(12): 1729-1733. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2021.12.022

关键词: ST段抬高型心肌梗死, 平均血小板体积, 死亡率, 生存分析

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CX26、CX32、CX43与上皮间质转化相关蛋白在结直肠原发癌和肝脏转移之间的相关性

张露, 杨燕, 苏方

2019, 44(12): 1621-1624, 1627. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.12.012

关键词: 结直肠肿瘤, 肝脏转移, 间隙连接蛋白, 上皮间质转化相关蛋白

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IVF-ET单侧输卵管切除对血清AMH水平及卵巢功能的影响

朱璇, 张爽爽, 张璐

2021, 46(10): 1404-1407. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2021.10.020

关键词: 单侧输卵管切除, 体外受精-胚胎移植, 血清抗苗勒管激素, 卵巢功能, 妊娠结局

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